D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Ο φυτοπαθογόνος μύκητας Colletotrichum coccodes προκαλεί επικίνδυνες ασθένειες σε πατάτες και ντομάτες γνωστές ως ανθρακονόζη και κόνδυλο. Με μορφολογικά χαρακτηριστικά, είναι συχνά δύσκολο να διακριθούν από ασθένειες που προκαλούνται από άλλους μικροοργανισμούς. Σε πράσινα φρούτα ντομάτας, η ασθένεια μπορεί να είναι ασυμπτωματική, εκδηλώνεται μόνο σε ώριμα κόκκινα φρούτα. Για γρήγορη και ακριβή διάγνωση του παθογόνου, προσφέρεται ένα σύστημα δοκιμών PCR σε πραγματικό χρόνο. Για να αναπτυχθεί ένα σύστημα δοκιμής, προσδιορίστηκε η νουκλεοτιδική αλληλουχία του γονιδίου τριφωσφορικής γλυκερόλης αφυδρογονάσης 45 στελεχών coccodes που απομονώθηκαν από κονδύλους πατάτας σε διαφορετικές περιοχές της Ρωσίας.
Με βάση τα αποτελέσματα που ελήφθησαν και την ανάλυση παρόμοιων αλληλουχιών άλλων ειδών που ήταν διαθέσιμες στη βάση δεδομένων GenBank, σχεδιάστηκαν οι ειδικοί για κάθε είδος εκκινητές και ανιχνευτής για C. coccodes. Για τον έλεγχο της ειδικότητας του δημιουργηθέντος συστήματος δοκιμής, πραγματοποιήθηκε PCR με DNA που απομονώθηκε από καθαρές καλλιέργειες 15 διαφορετικών ειδών παρασιτικών και σαπροτροφικών μυκήτων που σχετίζονται με φυτά τομάτας και πατάτας (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Η παρουσία του Colletotrichum coccodes DNA προσδιορίστηκε σε ένα κατώφλι 20-27, ενώ άλλα είδη ανιχνεύθηκαν μετά από 40 κύκλους ή δεν ανιχνεύθηκαν. Το σύστημα δοκιμής καθιστά δυνατή την αξιόπιστη ανίχνευση συγκεντρώσεων DNA C.cccodes που υπερβαίνουν τα 0.01 ng / mm3 στο αναλυθέν μείγμα PCR. Χρησιμοποιώντας το ανεπτυγμένο σύστημα δοκιμών, διερευνήθηκε η παρουσία C. coccodes σε φύλλα ντομάτας με συμπτώματα μυκητιασικών ασθενειών και σε κονδύλους πατάτας χωρίς εξωτερικά συμπτώματα της νόσου. Τα φύλλα με συμπτώματα μυκητιασικής λοίμωξης συλλέχθηκαν από δύο διαφορετικά πεδία στην επικράτεια του Κρασνοντάρ, κόνδυλοι - από χωράφια στις περιοχές Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Ένα φύλλο ντομάτας που περιείχε DNA C. coccodes βρέθηκε στην επικράτεια του Κρασνοντάρ. ανιχνεύθηκε σημαντική παρουσία DNA αυτού του παθογόνου σε 5 δείγματα κονδύλων που καλλιεργήθηκαν στις περιοχές Kostroma, Moscow, Kaluga.
Εισαγωγή
Οι μύκητες του γένους Colletotrichum είναι επικίνδυνα φυτοπαθογόνα που προσβάλλουν δημητριακά, λαχανικά, βότανα, πολυετή φυτά φρούτων και μούρων. Ένα από τα πανταχού παρόντα είδη αυτού του γένους, το Colletotrichum coccodes (Wallr).
Ο Hughes, είναι ο αιτιολογικός παράγοντας της ανθρακινόζης και της μαύρης κηλίδας πατάτας και ντομάτας, και προκαλεί ασθένειες πολλών άλλων φυτών της οικογένειας Solanaceae, συμπεριλαμβανομένων. ζιζάνια (Dillard, 1992). Ο C. coccodes μολύνει όλα τα υπόγεια μέρη του φυτού, τις βάσεις των βλαστών, τα φύλλα και τα φρούτα (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Κατά τη φλούδα των μολυσμένων κονδύλων πατάτας, παρατηρείται ανάπτυξη γκρίζων κηλίδων με αόριστα έντονα άκρα, στις οποίες είναι εμφανείς ορατές μαύρες κουκίδες σποριώδους και μικροσκληρωτίας. Κατά τη διάρκεια της αποθήκευσης, έλκη με μαλακό περιεχόμενο μπορούν να σχηματιστούν στον πολτό των κονδύλων, δηλ. η ασθένεια εισέρχεται στη φάση της ανθρακνόζης, η οποία, ωστόσο, είναι εξαιρετικά σπάνια.
Ταυτόχρονα, τα συμπτώματα της ανθρακνόζης (έλκη του δέρματος με μικρές μαύρες κουκκίδες) είναι χαρακτηριστικά στα φρούτα της τομάτας. Στα φύλλα, τα συμπτώματα του C. coccodes εμφανίζονται ως σκούρα καφέ κηλίδες, συνήθως οριοθετούνται με κίτρινο ιστό (Johnson, 1994).
Η ανάπτυξη μαύρης κηλίδας στους κόνδυλους καταστρέφει την εμφάνισή τους, η οποία είναι ιδιαίτερα έντονη κατά την πώληση πλυμένων πατατών κόκκινου φλοιού. Η απολέπιση της φλούδας οδηγεί σε υπερβολική εξάτμιση και αυξημένες απώλειες αποθήκευσης (Hunger, McIntyre, 1979). Η βλάβη σε άλλα φυτικά όργανα οδηγεί σε απώλειες απόδοσης, οι οποίες σημειώθηκαν τόσο σε ανοιχτό όσο και σε κλειστό έδαφος (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Οι ασθένειες που προκαλούνται από τους C. coccodes είναι συχνές σε όλες σχεδόν τις περιοχές που παράγουν πατάτες στον κόσμο, συμπεριλαμβανομένης της Ρωσίας (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Ο έλεγχος αυτών των ασθενειών είναι δύσκολος λόγω της ανεπαρκούς αποτελεσματικότητας των υπαρχόντων μυκητοκτόνων έναντι του C. coccodes και της έλλειψης ανθεκτικών ποικιλιών (Read, Hide, 1995).
Το εμβόλιο C. coccodes μπορεί να παραμείνει σε κόνδυλους σπόρων (Read, Hide, 1988; Johnson et al., 1997), οι σπόροι ντομάτας (Ben-Daniel et al., 2010), επιβιώνουν για μεγάλο χρονικό διάστημα στο έδαφος, σε συντρίμμια φυτών (Dillard, 1990) Dillard and Cobb, 1993) και στα ζιζάνια (Raid and Pennypacker, 1987). Τα έργα ενός αριθμού συγγραφέων (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) έδειξαν ότι η ανάπτυξη της νόσου σε πατάτες και ντομάτες εξαρτάται σε μεγάλο βαθμό από την παρουσία εμβολίου σε σπόρους και έδαφος. Ως εκ τούτου, προκειμένου να ελαχιστοποιηθούν οι απώλειες από την ασθένεια, είναι απαραίτητο να διαγνωστεί (συμπεριλαμβανομένων ποσοτικών) των πολλαπλασιασμών του μύκητα στο υλικό σπόρου, στο έδαφος, στους κονδύλους πατάτας σπόρου και στους σπόρους ντομάτας που έχουν αποθηκευτεί. Η μορφολογική διάγνωση στο έδαφος και στο φυτικό υλικό μπορεί να πραγματοποιηθεί μόνο με την παρουσία μικροσκοπίας, η οποία, ωστόσο, βρίσκεται και σε άλλους τύπους μυκήτων.
Τα συμπτώματα στους κόνδυλους είναι πολύ παρόμοια με την ασημένια ψώρα που προκαλείται από τον μύκητα Helminthosporium solani. Η απομόνωση των Colletotrichum coccodes και Helminthosporium solani σε καθαρή καλλιέργεια είναι μάλλον δύσκολη και απαιτεί πολύ χρόνο λόγω της αργής ανάπτυξης σε θρεπτικό μέσο. Για να αναγνωρίσετε γρήγορα τους κωδικούς Colletotrichum, είναι απαραίτητο να χρησιμοποιήσετε μεθόδους διάγνωσης. Η πιο βολική μέθοδος είναι η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και η τροποποίησή της - PCR σε πραγματικό χρόνο. Επί του παρόντος, ένα σύστημα δοκιμών που αναπτύχθηκε από Βρετανούς ερευνητές (Cullen et al., 2002) για την περιοχή ITS1 του rDNA χρησιμοποιείται στην Ευρώπη και τις Ηνωμένες Πολιτείες. Η χρήση του έχει δείξει καλά αποτελέσματα στην ανάλυση των ρωσικών προϊόντων απομόνωσης (Belov et al, 2018). Ωστόσο, οι C. coccodes είναι εξαιρετικά μεταβλητοί και η ανίχνευσή του από μία μόνο αλληλουχία DNA μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Για μια πιο αξιόπιστη διάγνωση, είναι απαραίτητο να αναλύσουμε αρκετές ειδικές αλληλουχίες DNA, σε σχέση με τις οποίες έχουμε αναπτύξει ένα πρωτότυπο σύστημα δοκιμών που μας επιτρέπει να αναγνωρίζουμε τους C. coccodes με την ακολουθία του γονιδίου γλυκεραλδεϋδης-3-φωσφορικής αφυδρογονάσης.
Υλικά και μέθοδοι
Για να εκτιμήσουμε την αποτελεσματικότητα και την εξειδίκευση των δημιουργηθέντων συστημάτων δοκιμών, χρησιμοποιήσαμε καθαρές καλλιέργειες 15 ειδών μυκήτων που απομονώθηκαν από τους συγγραφείς από ασθενή δείγματα φύλλων και φρούτων ντομάτας, κονδύλων πατάτας (Πίνακας 1). Για απομόνωση, ελήφθησαν όργανα φυτών με συμπτώματα μυκητιασικής λοίμωξης, όχι περισσότερο από ένα όργανο ανά θάμνο.
Μια φέτα ενός κονδύλου με φλούδα, μια φέτα ενός φρούτου ντομάτας και ένα προσβεβλημένο φύλλο τοποθετήθηκαν κάτω από ένα διοφθαλμικό μικροσκόπιο, μετά το οποίο το μυκήλιο, τα σπόρια ή ένα κομμάτι ιστού μεταφέρθηκαν σε ένα μέσο άγαρ (άγαρ μούχλας) σε ένα τρυβλίο Petri με μια οξεία βελόνα. Τα προϊόντα απομόνωσης αποθηκεύθηκαν σε κεκλιμένο άγαρ σε δοκιμαστικούς σωλήνες στους 4 ° C.
Δείγματα φύλλων τομάτας με συμπτώματα μυκητιασικών ασθενειών που προορίζονται για ανάλυση αμέσως μετά τη συλλογή (στο χωράφι) τοποθετήθηκαν σε 70% αιθυλική αλκοόλη στην οποία αποθηκεύτηκαν μέχρι την απομόνωση του DNA. Οι κόνδυλοι πατάτας παραδόθηκαν στο εργαστήριο, ξεφλουδίστηκαν (κομμάτι 2 × 1 cm) από αυτούς και καταψύχθηκαν στους –20 ° С. Αποθηκεύτηκε κατεψυγμένο μέχρι την απομόνωση DNA.
Οι καθαρές καλλιέργειες μυκήτων για απομόνωση DNA αναπτύχθηκαν σε υγρό μέσο μπιζελιού. Το μυκήλιο του μύκητα απομακρύνθηκε από το υγρό μέσο, ξηράνθηκε σε διηθητικό χαρτί, καταψύχθηκε σε υγρό άζωτο, ομογενοποιήθηκε, επωάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα CTAB, καθαρίστηκε με χλωροφόρμιο, καταβυθίστηκε με ένα μείγμα ισοπροπανόλης και 0.5 Μ οξικού καλίου, και πλύθηκε δύο φορές με 2% αλκοόλη. Το προκύπτον DNA διαλύθηκε σε απιονισμένο νερό και αποθηκεύτηκε στους –70 ° С (Kutuzova et al., 20). Η συγκέντρωση του DNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας ένα κιτ ποσοτικού προσδιορισμού DNA DNA για δίκλωνο DNA στο Qubit 2017 (Qiagen, Γερμανία). Τα αλκοολωμένα και κατεψυγμένα δείγματα κονιοποιήθηκαν σε υγρό άζωτο, στη συνέχεια η εκχύλιση DNA πραγματοποιήθηκε με τον ίδιο τρόπο όπως περιγράφηκε παραπάνω (για το μυκήλιο καθαρών μυκητιακών καλλιεργειών).
Πίνακας 1. Προέλευση των χρησιμοποιημένων στελεχών μυκήτων
Όνομα μανιταριού | Φυτό, όργανο | Τόπος επιλογής |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | κονδύλων πατάτας | Περιοχή Κοστρώματος, κονδύλους πατάτας της 1ης γενιάς αγρού, ποικιλία Red Scarlett |
Κοκκωδικοί Colletotrichum 4 | φύλλο πατάτας | Μαλλομέταξο ύφασμα. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | κονδύλων πατάτας | Περιοχή Μαγκαντάν, θέση Σκηνή, κονδύλων πατάτας |
Cladosporium fulvum | φύλλα ντομάτας | Περιοχή της Μόσχας, ντομάτα με μεγάλη καρποφορία |
Τοματοφίλα Alternaria | φρούτα ντομάτας | παραδίδεται από το προσωπικό του εργαστηρίου μυκολογίας και φυτοπαθολογίας του All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | φρούτα ντομάτας | Krasnodar Territory, περιοχή Krymsky, βαθμός Κρέμα |
Fusarium oxysporum | ρίζα σιταριού | Περιοχή Μόσχα |
Η PCR πραγματοποιήθηκε σε ενισχυτή DTprime (DNA-Technology). Για PCR, χρησιμοποιήθηκαν αρχικοί εκκινητές και ένας ανιχνευτής για την ειδική περιοχή του γονιδίου τριφωσφορικής γλυκερόλης αφυδρογονάσης: εμπρός αστάρι Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, αντίστροφος εκκινητής Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Οι εκκινητές ενισχύουν μια περιοχή 213 bp.
Η αντίδραση πήρε 50 ng ολικού DNA (στην ανάλυση των φύλλων και των κονδύλων) και 10 ng (στην ανάλυση του DNA καθαρών καλλιεργειών μυκήτων). Το μείγμα της αντίδρασης (35 μl) διαχωρίστηκε με ένα στρώμα παραφίνης σε δύο μέρη: το κατώτερο (20 μl) περιείχε 2 μl 10 × ρυθμιστικό αντίδρασης (750 mM Tris-HCl, ρΗ 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4, 25 mM MgCl2, 0.1% Tween- 20), 0.5 mM εκάστου τριφωσφορικού δεοξυνουκλεοτιδίου, 7 pmol εκάστου εκκινητή και 4 pmol υδρολύσιμου φθορίζοντος ανιχνευτή. το ανώτερο περιείχε 1 μl ρυθμιστικού 10 × PCR και 1 U πολυμεράσης Taq.
Ο διαχωρισμός του μείγματος με παραφίνη επιτρέπει στους σωλήνες να αποθηκεύονται για μεγάλο χρονικό διάστημα σε θερμοκρασία 5 ° C και να παρέχουν θερμή εκκίνηση για PCR μετά από θέρμανση τους για 10 λεπτά σε θερμοκρασία άνω των 80 ° C. Η PCR πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με το ακόλουθο πρόγραμμα: 94.0 ° C - 90 s (1 κύκλος). 94.0 ° C - 30 δευτερόλεπτα; 64.0 ° C - 15 s (5 κύκλοι); 94.0 ° C - 10 δευτερόλεπτα; 64.0 ° C - 15 s (45 κύκλοι); 10.0 ° C - αποθήκευση.
Αποτελέσματα και συζήτηση
Οι αλληλουχίες του γονιδίου τριφωσφορικής γλυκερόλης αφυδρογονάσης προσδιορίστηκαν σε 45 στελέχη που απομονώθηκαν από φύλλα, στελέχη, κονδύλους πατάτας και φρούτα ντομάτας (Kutuzova, 2018) σε διαφορετικές περιοχές της Ρωσίας. Οι μελετημένες αλληλουχίες όλων των στελεχών χωρίστηκαν σε 2 ομάδες που διαφέρουν σε δύο νουκλεοτίδια. Οι νουκλεοτιδικές αλληλουχίες εκπροσώπων και των δύο ομάδων με τους αριθμούς ΚΥ496634 και ΚΥ496635 κατατίθενται στο GenBank.
Οι εναρκτήρες coc70gdf, coc280gdr και ο ανιχνευτής cocgdz που σχεδιάστηκαν βάσει αυτών ελέγχθηκαν χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) σε όλες τις αλληλουχίες του γονιδίου τριφωσφορικής γλυκερόλης αφυδρογονάσης των ειδών του γένους Colletotrichum και άλλων οργανισμών που διατίθενται στη βάση δεδομένων GenBank.
Δεν βρέθηκαν περιοχές DNA άλλων οργανισμών που είναι πολύ ομόλογες με τους εκκινητές και τον ανιχνευτή.
Η ευαισθησία του συστήματος δοκιμής ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας δείγματα με διαφορετικές συγκεντρώσεις DNA C. coccodes, DNA ενός φύλλου πατάτας μολυσμένο με ανθρακόζη (συλλέχθηκε το 2017 στο Mari El, ποικιλία Red Scarlett) και φλούδα κονδύλων που επηρεάστηκαν από μαύρη κηλίδα (συλλέχθηκαν στην περιοχή Kostroma ποικιλία Red Scarlett, Πίνακας 2). Για να επιβεβαιωθεί η παρουσία DNA σε κονδύλους και φύλλα πατάτας, στελέχη C. coccodes απομονώθηκαν από αυτά σε καθαρές καλλιέργειες.
Τα αποτελέσματα της ανάλυσης ευαισθησίας του δοκιμαστικού συστήματος δείχνουν ότι μπορεί να χρησιμοποιηθεί με επιτυχία για τη διάγνωση της παρουσίας DNA C. coccodes σε ένα δείγμα όταν το συνολικό περιεχόμενό του στο μείγμα PCR είναι μεγαλύτερο από 0.05 ng. Αυτό είναι αρκετά επαρκές για την ανίχνευση, δεδομένου ότι ένα σκληρόotia περιέχει, κατά μέσο όρο, 0.131 ng και ένα σπόρο περιέχει περίπου 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Το σύστημα δοκιμής που αναπτύχθηκε από την αγγλική ομάδα (Cullen et al., 2002) έδειξε παρόμοια ευαισθησία (κύκλος κατωφλίου 34 στα 0.05 ng DNA και 37 στα 0.005 ng).
Η ανάλυση φυσικών δειγμάτων που περιέχουν C. coccodes σε όλες τις περιπτώσεις κατέστησε δυνατή την αξιόπιστη αποκάλυψη της παρουσίας του στο δείγμα (Πίνακας 2). Η προτεινόμενη μέθοδος απομόνωσης DNA ήταν επίσης εφαρμόσιμη στην ανάλυση φυσικών δειγμάτων φυτών.
Πίνακας 2. Προσδιορισμός της ευαισθησίας του προτεινόμενου συστήματος δοκιμής για την ταυτοποίηση των Colletotrichum coccodes για PCR σε πραγματικό χρόνο
Образец | Η ποσότητα του DNA στο δείγμα *, ng | Κύκλος κατωφλίου | Γ. Ανίχνευση κωδικών |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum κωδικοί κωδικοί | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Φλούδα κονδύλου 1 | 50 | 32 | + |
Φλούδα κονδύλου 2 | 50 | 30 | + |
Φλούδα κονδύλου 3 | 50 | 31.5 | + |
Φύλλο πατάτας | 50 | 29.5 | + |
Σημείωση. * Σε ένα μείγμα προϊόντων PCR.
Η ειδικότητα του συστήματος δοκιμής δοκιμάστηκε σε δείγματα DNA που εξήχθησαν από 15 είδη μυκήτων. Όλα τα στελέχη μυκήτων απομονώθηκαν από τους συγγραφείς από προσβεβλημένα και υγιή φρούτα και φύλλα ντομάτας, κονδύλων πατάτας. ένα στέλεχος απομονώθηκε από τη ρίζα του σίτου (Πίνακας 1). Μεταξύ των ειδών που απομονώνονται από την επιφάνεια του καρπού, υπάρχουν επίσης είδη που δεν είναι παθογόνα για την ντομάτα (για παράδειγμα, Phellinus ferrugineovelutinus).
Μελέτες έχουν δείξει ότι το DNA C. coccodes ανιχνεύθηκε σε έναν κύκλο κατωφλίου 20-27, ενώ άλλα μυκητιακά είδη δεν ανιχνεύθηκαν ή έδωσαν σήμα μετά τον κύκλο 40, το οποίο μπορεί να αποδοθεί σε μη ειδική επίδραση θορύβου (Πίνακας 3).
Πίνακας 3. Δοκιμή του συστήματος δοκιμών για διάφορους τύπους μανιταριών
Όνομα μανιταριού | Κύκλος κατωφλίου |
Colletotrichum κωδικοί κωδικοί 1 | 20.9 |
Γ. Κωδικοί 2 | 22.6 |
Γ. Κωδικοί 3 | 23 |
Γ. Κωδικοί 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
ΣΤ. Verticillium | > 40 |
Ριζοκόνια Solani | > 40 |
Phomopsis Phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. Τοματοφίλα | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
Γ. Fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Σημείωση. * Η ποσότητα του DNA σε όλα τα δείγματα ήταν 10 ng.
Το αναπτυγμένο σύστημα δοκιμής χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό C. coccodes σε δείγματα φύλλων τομάτας με συμπτώματα νεκροτροφικών παθογόνων και κονδύλων πατάτας σπόρου χωρίς ορατά συμπτώματα. Για τη μελέτη, πήραμε κόνδυλους σπόρων διαφορετικών ποικιλιών που καλλιεργούνται στις περιοχές Kostroma, Moscow, Kaluga, Nizhny Novgorod. Η παρουσία DNA C. coccodes θεωρήθηκε σημαντική στα δείγματα, στην ανάλυση των οποίων ο κύκλος κατωφλίου δεν ξεπέρασε το 35. Αυτή η τιμή κατωφλίου επιλέχθηκε με βάση τον αξιόπιστο προσδιορισμό 0.05 ng DNA C. coccodes (κύκλος κατωφλίου 33.5, Πίνακας 2) και το γεγονός ότι κατώφλι κύκλων άνω των 40, διαγνώστηκε μη ειδικό DNA ορισμένων άλλων ειδών μυκήτων. Με αυτήν την προσέγγιση, η σημαντική παρουσία του C. coccodes DNA ανιχνεύθηκε σε 5 δείγματα κονδύλων που καλλιεργήθηκαν στις περιοχές Kostroma, Moscow, Kaluga και σε ένα φύλλο ντομάτας από την περιοχή Yeisk της περιοχής Krasnodar (Πίνακες 4, 5).
Πίνακας 4. Ανίχνευση κοκωδών Colletotrichum σε κονδύλους πατάτας *
Αριθμός δείγματος | Ποικιλία πατάτας | Τόπος ανάπτυξης | Γ. Ανίχνευση κωδικών | Κύκλος κατωφλίου |
---|---|---|---|---|
1 | Κόκκινο κόκκινο | Περιοχή Κοστρώματος | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Σαντ | Περιοχή Μόσχα | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky νωρίς | Περιοχή Μόσχα | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | υποκοριστικό της Mary | Καλούγκα περιοχή. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Φαντασία | Καλούγκα περιοχή. | - | |
15 | Γκάλα | Νίζνι Νόβγκοροντ περιοχή | - | |
16 | - |
Σημείωση. * Η ποσότητα του DNA σε όλα τα δείγματα ήταν 50 ng.
Πίνακας 5. Ανίχνευση κοκωδών Colletotrichum σε φύλλα ντομάτας *
Αριθμός δείγματος | Τόπος ανάπτυξης | Γ. Ανίχνευση κωδικών | Κύκλος κατωφλίου |
---|---|---|---|
1 | Έδαφος Κρασνοντάρ, Κριμαία | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Έδαφος Krasnodar, Επαρχία Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Η ποσότητα του DNA σε όλα τα δείγματα ήταν 50 ng.
Το σύστημα δοκιμών που δημιουργήθηκε από εμάς δεν είναι κατώτερο από αυτό που αναπτύχθηκε από Βρετανούς ερευνητές (Cullen et al., 2002) ως προς την ευαισθησία και την ειδικότητα και είναι κατάλληλο για την ανάλυση των δειγμάτων φυτών. Η εφαρμογή του για την ανάλυση των κονδύλων σπόρων κατέστησε δυνατή την αναγνώριση του C. coccodes DNA σε κονδύλους χωρίς εξωτερικά σημάδια βλάβης και την επιτυχημένη ανάλυση της μόλυνσης των φύλλων.
Μέχρι σήμερα, δεν πραγματοποιήθηκε καμία ανάλυση των κονδύλων πατάτας για την προσβολή των C. coccodes στη Ρωσία. Η πρώτη μας μελέτη έδειξε ότι από τους 16 δοκιμασμένους κόνδυλους σπόρων που καλλιεργούνται σε διαφορετικές περιοχές της Ρωσικής Ομοσπονδίας, 5 περιέχουν C. coccodes. Αυτό δείχνει ότι η μαύρη κηλίδα των κονδύλων πατάτας είναι μια κοινή ασθένεια πατάτας στη Ρωσία και ο ρόλος της στη μείωση του όγκου και της ποιότητας της καλλιέργειας πατάτας είναι υποτιμημένη.
Η ανάλυση των φύλλων ντομάτας αποκάλυψε σημαντική παρουσία DNA C. coccodes σε ένα φύλλο από την περιοχή Yeisk του Krasnodar Territory. Νωρίτερα, όταν εξετάσαμε χωράφια ντομάτας στη νότια Ρωσία χρησιμοποιώντας το βρετανικό σύστημα δοκιμών (Cullen et al., 2002), εντοπίστηκαν φύλλα που περιείχαν C. coccodes, και σε ορισμένα πεδία βρέθηκε μεγάλο ποσοστό φύλλων μολυσμένων με C. coccodes (Belov et al., 2018). Στα εδάφη Krasnodar και Primorsky, στην Περιφέρεια της Μόσχας, βρήκαμε φρούτα ντομάτας, από τα οποία καταφέραμε να απομονώσουμε αγνές καλλιέργειες του C. coccodes. Είναι πιθανό ότι οι C. coccodes είναι πολύ πιο διαδεδομένοι στην ντομάτα στη Ρωσία από ό, τι πιστεύεται τώρα, και η βλαβερότητά του είναι επίσης υποτιμημένη.
Έτσι, μέχρι σήμερα, έχουν συγκεντρωθεί αρκετές πληροφορίες για την ευρεία διανομή των C. coccodes στις πατάτες και τις ντομάτες.
Για να κατανοήσουμε καλύτερα τον ρόλο αυτού του μύκητα στην ανάπτυξη παθήσεων πατάτας και ντομάτας, είναι απαραίτητο να παρακολουθείται ο επιπολασμός του στη Ρωσία, να μελετάται ο ρόλος των μολύνσεων του εδάφους και των σπόρων και ο ρόλος της μαύρης κηλίδας στις απώλειες κατά την αποθήκευση. Η χρήση διαγνωστικών PCR μπορεί να διευκολύνει σημαντικά αυτό το έργο και η ταυτόχρονη χρήση και των δύο συστημάτων δοκιμής θα αυξήσει σημαντικά την ακρίβεια της ανάλυσης.
Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορήγηση από το Ρωσικό Ίδρυμα Επιστημών αριθ. 18-76-00009.
Το άρθρο δημοσιεύθηκε στο περιοδικό "Mycology and Phytopathology" (τόμος 54, Νο. 1, 2020).